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质料提取得率和纯度常见问题及解决方法
      质粒提取得率和纯度与很多因素有关如菌种、培养基种类、质粒拷贝数、处理培养液体积和吸附柱容量等。在质粒提取过程中,最常出现的问题主要是裂解步骤,应小心操作。下面列出几种常见问题及可能原因:

未提出质粒或质粒得率较低

菌体中无质粒: 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经过多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

碱裂解不充分: 使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液SolutionISolution IISolution III的用量。对低拷贝数质粒,提取时,可加倍使用Solution I Solution IISolution III,可能有助于提高质粒得率和质粒质量。

溶液使用不当: Solution Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。

吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。

浓缩漂洗液第一次使用前应加入一定体积的无水乙醇:  加入体积见使用方法和瓶上标签,如果未加入无水乙醇,会将质粒从吸附柱上溶出。加入乙醇后的浓缩漂洗液每次用后应拧紧瓶盖。

未使用洗脱缓冲液溶解质粒:  使用TE缓冲液(PH8)或去离子水溶解质粒也可,但要检查所用溶液PH和离子浓度是否正确,PH值应为8左右,如果PH过低可能导致洗脱量低。

质粒未全部溶解(尤其质粒较大时):  洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。

乙醇残留:  漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。

◆质粒纯度不高

某些序列在菌体中难以长时间保存,例如: COS质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,所以每次都应挑取单菌落进行培养。

混有蛋白: 不要使用过多菌体。Solution I, Solution II, Solution III处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。

混有RNA: RNaseA 处理不彻底,请减少菌体用量或加入Solution III后室温放置一段时间。如果溶液已保存6个月以上,请在Solution I中添加RNaseA.

混有基因组DNA: 加入Solution IISolution III后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA 剪切成碎片从而混杂在质粒中.如果加入Solution II后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用量.

裂解时间过长:  加入Solution II后裂解时间不应超过5分钟。

质粒的二聚体和多聚体形式: 是在质粒复制过程中形成的,与宿主相关,电泳可检测出。

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