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基因组DNA提取的多种用途

从各种不同来源样品,如细菌、酵母、血液、动物组织、动物细胞、植物组织和植物细胞中提取高纯度的基因组DNA。提取的基因组DNA片段50-150 kb。用户可根据需要选用不同的抽提溶液来进行不同样品的抽提。

  文库构建

  基因图谱

  Southern-Blotting

  PCR

可处理样品

血液/组织/培养细胞/鼠尾/酵母/细菌(革兰氏阴性和一些革兰氏阳性菌)。

使用样品

最好使用新鲜的样品或取样后立即在-20℃或-70℃冷冻的,不应使用多次冻融的样品,因为这会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。对于具有较难处理细胞壁的细菌或酵母菌,应在对数生长期早期收集菌体。

基因组提取试剂盒使用注意事项:

处理样品的最大量

动物组织

30mg

小鼠尾

0.6-1.2cm

大鼠尾

0.6cm

培养细胞

5X106

细菌

2X109

酵母

5X107

对一些DNA含量较大的组织,如脾脏,应使用小量最大样品量的用量。

如果所使用的样品未在表列出,建议先使用最大使用量的一半,检测提取情况。

以下数据可作为估计样品用量的参考表1-1

Multiwell

Plates培养面积cm2

细胞数

96-well

0.32

4-5X104

48-well

1

1X105

24-well

2

2.5X105

12-well

4

5X105

6-well

9.5

1X106

Dishes

Plates培养面积cm2

细胞数

Φ35mm

8

1X106

Φ60mm

21

2.5X106

Φ100mm

56

7X106

Φ145-150mm

145

2X107

Flasks

Plates培养面积cm2

细胞数

40-50ml

25

3X106

250-300ml

75

1X107

650-750ml

162-175

2X107

动物组织

多数动物组织每2mm2重约10-15mg

动物细胞

Hela细胞在不同培养皿中得率见表1-1Hela细胞约长15nm左右,各种细胞大小不同,得率也有不同。

细菌和酵母

细菌和酵母的生长情况通常用分光光度计来检测,但很难给出确定的细胞数和OD值的对应关系来,细胞密度受很多因素影响,如菌株种类,摇速等。不同菌株在特定的波长处显现出不同的吸收值(如600436nm)。检测OD值时,应使OD值在0.050.3之间,如果数值超过0.3,则应该稀释样品。

下面的数值可作为粗略的估计:大肠杆菌培养物1X109 cells/ml1:4稀释.

OD600值使用Beckman DU-7400检测时为0.25,使用Beckman DU-40检测时为0.125

Proteinase K: 试剂盒中提供的Proteinase K 浓度为10mg/ml

样品直接用Proteinase K处理即可,不必用机械外力打碎,但动物组织应先切成小块。

RNA污染

使用本系列试剂盒提取基因组DNA的同时,如果样品中有RNA,也会同时提取出来,尤其肝,肾等RNA含量高的组织,提取的RNA较多。RNA存在不会影响PCR的进行,但有可能影响后面的一些酶切或其它实验。如果需要提取不含RNA的基因组DNA,可在实验过程中加入RNaseA,加入量不要超过20μl,具体操作见说明书。

基因组DNA的洗脱

对不多于10μg DNA,用100μl洗脱缓冲液洗脱一次即可。超过10μg,建议洗脱两次,大约第一次可洗脱60-80%。如果多于30μg建议用3X100μl3次,会提高回收量。如果DNA量较少(如少于1μgDNA),只用50μl 洗脱一次即可,如果要使用去离子水溶解DNA,请确定水的PH值不低于7,但如果需要长期保存,仍然建议使用洗脱缓冲液,因为用水保存的DNA有可能会发生酸解。

预计得率

◇动物组织:每毫克组织0.2-1.2μg DNA

◇鼠尾:10-40μg DNA(根据种类,年龄和鼠尾长度不同而不同。)

◇哺乳动物细胞:每个细胞6pg DNA6μg/106 cells

纯度检测

DNA纯度可用分光光度计检测,DNA260nm处有光吸收值。检测时应使OD值在0.151.0之间,数值比较准确。样品稀释要适当:例如,25-50ng/ml DNAA260=0.5-1.0)的样品不应使用超过4倍体积的水稀释。可以检测260nm处的吸收值,也可以在220-330nm之间进行扫描。(扫描可以检测是否有其它因素影响OD260,如在325nm处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)A 26011cm 夹缝)相当于50μg DNA

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