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提取RNA所遇问题的解决方法
 提取  RNA  所遇问题,可能原因及解决办法

问题

可能原因

建议办法

RNA  产量过低

·所制 RNA 不完全溶解

·组织等样品匀浆破裂不完全

匀浆这一步非常重要!许多实验的失败,或者使用国产 Trizol 效果不佳,都是因为这个原因!

·在加入 Trizol 前,处理样品时间过长

·以如下方法增加溶解量,在55℃,加热10-15分钟的条件下,用SDSDEPC处理的水溶解RNA沉淀,并反复吹吸RNA沉淀,RNA不要冻干或真空抽干;避免样品过分干燥(如沉淀变透明,说明已经过度),离心收集RNA沉淀时,不超过12000g

·确认没有颗粒状样品残留,在样品匀浆后,室温温浴5分钟

·建议使用带有锯齿状电动匀浆头的匀浆机,玻璃匀浆器或者研钵(手动匀浆)均不是最佳选择!

·动物组织样品取材后应迅速进行分离实验,对培养细胞组织,直接加入 Trizol Reag ent,省略冲洗和胰酶消化步骤

RNA  降解

·RNA 存放不当

·冻存样品在未加 Trizol Reagent 情况下融化

·酚氯仿等有机溶剂残留在RNA 样品量过大

·RNA 储存温度是-70℃而非-20

·在冻存材料中直接加 Trizol

·不要将有机相带入 RNA 样品

A260/280值过低

<  1.65

·加入 Trizol Reagent 中的样品量过大

·溶液 PH 为酸性

·样品浓度过高

·有机水相界面处物质含有 DNA

·Trizol Reagent 用量不足

· 1m1 TRIzol Reagent 最多可有于50mg 组织或1000000 个细胞,一定要在匀浆后室温浴 5 分钟

· TE 而不是水中溶解样品

· 稀释样品使 A260A280 值进入线性范围

· 转移水相时不要吸入界面物质

· 1m1 Trizol Reagent 最多可用于 50mg 组织或,1,000,000 个细胞

RNA中含有

DNA杂质

·细胞或组织中含有有机溶剂

·氯仿抽提前未去除不溶物,它们可能

  吸附 DNA

·原始样品中不能含有乙醇、DMS0 等有机溶剂

·在加入氯仿前去除颗粒状样品

·在已提取出来的 RNA 样本中再加入适量 Trizol,重新再提取一次;或者在原始的提取样品中按照100-200μ1 冰乙酸/ml Trizol 的比例加入冰乙酸,再做后续的提取过程

RNA 所在水相有颜色

·高脂肪含量的组织(如皮肤), 处理后,油脂形成微胶粒,离心时不能彻底分离到水相上层,它们从Trizol  Reagent 中溶解红色物质

·样品中含有较多血红蛋白时,水相呈黄色或棕色

·水相在加入异丙醇后变为黄色

·在加入氯仿前先离心除去上部的油脂层

·减少样品量

·用新鲜的异丙醇

加入Trizol Reagent后细胞末脱离培养瓶壁

·常见于处理一些附着力强的细胞

·加入Trizol  Reagent 放置 2-3 分钟,刮下细胞后放置数分钟,收集细胞。在瓶壁表面反复吹吸,再转移到离心管中

有机相/

水相不分层

· Trizol Reagent 用量不足

·样品量过大,蛋白含量过多

·在提取的样品中加入适量氯仿,再振荡,静止后

有机相与水相会自动分层

有机相/水相颠倒

·溶液酸碱性不对

·可以在样本中加入适量DEPC处理过的 ddH2O.  振荡后,静置,有机相与水相会自动翻转

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