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DNA聚合酶常见问题解决方法
 

Taq酶部分

使用 Taq 酶扩增的 PCR 产物如何进行 TA 连接?

使用 Taq 酶的 PCR 扩增产物在3′端有一个附加的 A碱基,可进行 TA 连接。BioDev 公司的Taq 酶反应缓冲液中没有抑制连接反应的成分,PCR产物如果没有非特异性杂带,不需进行纯化,可直接用于连接。但鉴于 PCR 产物中多数会有引物二聚体存在,建议纯化后再进行连接。

Pfu酶部分

使用 Pfu 可以扩增多长的片段?

对于简单模板,Pfu应该可以很好地扩增3 kb以下片段。扩增更长片段时,能否成功扩增主要与模板和引物的设计有关。

使用 Pfu 进行PCR扩增后的PCR产物能否进行TA克隆?

可以进行TA克隆,也可选用平末端加A后与TA载体连接的克隆载体试剂盒。

用同等单位的PfuTaq扩增,为什么Pfu扩增效率比 Taq酶低?

因为高保真性能的Pfu聚合酶具有3′和5′核酸外切酶的活性,扩增途中如果产生了错配的碱基,它可以将其切掉,从而保证了扩增的准确性。正是由于此酶具有核酸外切酶功能,往往扩增效率比Taq要低,而且还容易降解引物,因而在设置PCR反应时,应最后加入Pfu酶为好。

使用Pfu酶扩增时,以引物设计有何要求?

Pfu酶扩增时,引物的纯度要求较高,引物长度大于18个碱基,Tm55-80℃之间,引物浓度在0.1-0.5μM之间,比Taq酶略高。

HotStart酶部分

HotStart Taq使用上有什么特异性?

经过化学修饰的耐热DNA聚合酶。此酶在常温下,活性被封闭,要在94-95℃加热数分钟才能恢复正常活力开始反应,避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增,提高了PCR反应的灵敏度及特异性。一般用于扩增基因组等复杂模板,可大大提高PCR扩增的特异性。

Taq Plus酶部分

使用 Taq  Plus 可以扩增多长的片段?

一般情况下,Taq  Plus 应该可以很好地扩增 10 kb以下片段。能否成功扩增更长片段,主要与模板的结构和引物的设计有关,如果扩增长片段有困难,最好选用Long Taq DNA 聚合酶。

使用 Taq  Plus 进行PCR扩增后的PCR产物能否进行TA克隆?

PCR产物可直接进行TA载体克隆,但效率可能会略低于Taq,建议最好先将PCR产物进行纯化,然后经过加A处理,再与TA载体连接,这样可大大提高克隆效率。

其他

PCR 产物需用限制酶进行消化时,需不需要进行Buffer 交换?

在通常情况下,首先需把PCR产物进行纯化后再进行酶切,可以选用BioDev公司生产的DNA产物纯化试剂盒,该试剂盒回收效率可达90%以上。但如果只用PCR反应液的一部分(1-5μl)进行酶切时,可以直接使用限制酶进行大于20μl体系的酶切反应。

PCR 产物经末端平滑后克隆于去磷酸的平滑末端载体时,其PCR产物需不需要进行5′末端磷酸化?

需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷(除非在合成时特别标记)。使用这种引物进行PCR的产物经末端平滑化后,与去磷酸的平滑末端载体连接之前,必须进行末端磷酸化。

如何提高PCR扩增的保真性

下游应用为基因筛选、测序、突变检测和分子诊断等的用户,对PCR保真性要求很高。降低PCR扩增的错误率可以通过使用各种具有高保真性的DNA聚合酶来实现。DNA聚合酶的保真度用错误率来表示,包括碱基错配率PCR产物突变查分数等。在目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中,Pfu酶的出错率最低,保真度最高。除对酶进行选择,研究者也可通过优化反应条件来进一步减少PCR突变率,包括优化缓冲液组成,耐热聚合酶的浓度及对PCFR循环条件进行优化等。

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