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如何提高RT-PCR反应的灵敏度
 

首先应确定模板RNA完整性好,无DNA污染。

样品取样后应立即提取或放在RNAsiore样品储存液中保存,以避免RNA降解。

采用较好的RNA提取方法,如Trizol等提取试剂盒,可避免RNA降解并最大限度减少DNA污染。

RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。

RNA模板中若有乙醇、DMSOSOS和甲酰胺之类的试剂,都会抑制逆转录和PCR反应,如果怀疑污染了抑制

剂,应先进行纯化。

为了防止模板降解,可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin

使用适量模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

对于<50 ngRNA样品,可以在第一链cDNA合在中使用0.1μg0.5μg乙酰BSA

镁离子浓度对反应结果影响很大。

可从1 mM3 mM,间隔0.5 mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。

注意:对实时定量PCR,使用3 mM5 mM的镁离子浓度。

设计引物时,避免在引物3′端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。另外,设计时应该考虑设

Tm值相近的引物。

反应体系尽量不要超过50μl,否则可能导致cDNA产量降低。

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